Terapia te powstała na Uniwersytecie Pensylwanii, który sprzedał licencję na prowadzenie badań w tym kierunku firmie Novartis. Zatwierdzona przez FDA terapia dotyczy wyłącznie osób do 25 roku życia, chorujących na pewien podtyp ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL, Acute Lymphoblastic Leukemia) na podtyp r/r (relapsed, refractory), czyli tak zwany nawracający i odporny. Firma Novartis najprawdopodobniej jeszcze w tym roku będzie ubiegała się o zgodę na objęcie terapią dorosłych z nawracającym i odpornym chłoniakiem limfocytów B.

Droga, ale skuteczna

Lek zawiera zmodyfikowane genetycznie/przeprogramowane w warunkach laboratoryjnych limfocyty T osoby chorej, które wytwarzają pewne receptory mające rozpoznawać komórki nowotworowe. Podczas terapii komórki te zostaną wprowadzone ponownie przełomowe w ciało pacjenta, gdzie rozpoznając odpowiednie komórki nowotworowe pomogą organizmowi je wyeliminować. Terapia jest droga (ok. 500 tys. dolarów na osobę), ale za to bardzo skuteczna. Według opublikowanych badań, u ponad 80% chorujących na ALL r/r nastąpiła remisja choroby i powrót do normalnego życia. Ta terapia jest bardzo ważna dla tych chorujących na ALL, którzy w ogóle nie reagują na klasyczny rodzaj leczenia. Dla nich ostatnim ratunkiem może być lek/ terapia opracowana przez firmę Novartis. Trzeba też wziąć pod uwagę, że ta terapia to bardzo poważna ingerencja w system odpornościowy, która ma i może mieć jeszcze więcej działań niepożądanych.

Koncepcja terapii genowej

Podstawowa koncepcja terapii genowej jest prosta: skoro wystąpił błąd w ekspresji DNA w komórce, należy to naprawić za pomocą wprowadzenia odpowiednio funkcjonującego genu lub zablokować ekspresję genu źle funkcjonującego. Jeśli podstawowa technologia dla tych dwóch podejść zostanie opracowana, to zakres i efektywność z korzyści terapeutycznej może być ogromna. Te nowe podejścia w leczeniu będą dotyczyć nie tylko chorób nowotworowych, ale i chorób rzadkich o podłożu genetycznym. Terapie przeciwnowotworowe mogą być przeprowadzone w warunkach ex vivo, podobnie jak w wyżej wymienionym przypadku.

Kolejną korzyścią tej nowoczesnej terapii będzie docelowość. Mianowicie jedna konkretna terapia może wyeliminować długotrwałe i wielolekowe leczenie, które jest bardzo uciążliwe dla pacjenta. Dla osób z nowotworami kolejną korzyścią może być spowolnienie rozwoju choroby.

Dzisiaj dysponujemy już wieloma metodami do inaktywacji lub wprowadzenia dodatkowych (naprawionych) genów. Wprowadzenie nowych genów przeprowadza się przede wszystkim za pomocą wektorów wirusowych. Jedna z klasycznych metod polega na ukierunkowanej modyfikacji DNA w macierzystych komórkach embrionalnych (ESC, embryonic stem cells) z wykorzystaniem zjawiska rekombinacji homologicznej. Wprowadzany obcy DNA otoczony jest sekwencjami homologicznymi do DNA w miejscu pożądanej integracji.

Główną przeszkodą w uzyskiwaniu szczepów ze swoistymi modyfikacjami jest niska wydajność integracji transgenu w swoistym locus (obszar chromosomu zajmowany przez gen). Wiele czynników może wpływać na częstotliwość swoistej integracji, np. metoda wprowadzania wektorów do komórek czy długość ramion homologicznych matrycy donorowej.

Zastosowanie endonukleaz – bez efektów

Badania prowadzone pod koniec lat 80. wykazały, że dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB, double-strand break) w obrębie sekwencji docelowej drastycznie zwiększa częstotliwość rekombinacji homologicznej. Te pęknięcia DNA są naprawiane w dwa sposoby: przez łączenie nici w procesie niehomologicznej naprawy rekombinacyjnej (NHEJ, non-homologous end joining) lub przez rekombinację homologiczną. Modyfikacje genomu z użyciem programowanych nukleaz opierają się na powstawaniu dwuniciowych pęknięć w DNA tworzonych przez endonukleazy w miejscu wybranym i są określane jako edycja genomu (genome editing). W latach 90. po raz pierwszy wykazano modyfikację genomu z użyciem endonukleaz.

Zastosowanie endonukleaz rozpoznających pożądane sekwencje nie przyniosło dobrych efektów, głównie przez brak jasnego powiązania między sekwencją aminokwasową endonukleaz a swoistością rozpoznawania konkretnej sekwencji DNA.

Kolejnym krokiem było stworzenie nukleaz z domeną palca cynkowego (zinc finger nucleases, ZFN). Są to białka fuzyjne łączące domeny DNA bazujące na eukariotycznych czynnikach transkrypcyjnych.

Niestety poza wieloma trudnościami (mogą niespecyficznie przecinać nić DNA) enzymy ZFN charakteryzują się także cytotoksycznością. W ciągu ostatnich kilku lat możliwości edycji genomu poszerzyły się o takie narzędzia, jak białka TALEN (TALE nucleases). Nukleazy te są podobne do ZFN, jednak domeny z motywem palca cynkowego zostały zastąpione domenami wiążącymi DNA z białkami bakterii z rodzaju Xanthomonas.

Przełom

Przełom w edycji genomów nastąpił dopiero niedawno, kiedy w 2012 Jennifer Doudna, z Uniwersytetu Kalifornii i Emanuelle Charpentier, z Instytutu Maxa Plancka, opublikowali mechanizm działania systemu CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-associated). W tym systemie za swoistość rozpoznawania DNA odpowiada nie białko – jak w przypadku ZFN czy TALEN – ale krótka, komplementarna cząsteczka RNA. Jest to dość powszechny system odporności nabytej bakterii i archeonów przeciwko obcym elementom genetycznym, jak plazmidy czy wirusowe kwasy nukleinowe.

W działaniu systemu CRISPR-Cas można wyróżnić trzy podstawowe etapy: adaptację, ekspresję i interferencję. Podczas adaptacji, krótki fragment pochodzący z wirusowego lub plazmidowego DNA zostanie włączany do locus CRISPR. Długość włączanych sekwencji wynosi 21-72 nukleotydów; najczęściej są to fragmenty 32-38-nukleotydowe. Po adaptacji następuje ekspresja – powstaje długi pierwotny transkrypt, obejmujący wszystkie sekwencje powtórzone i wszystkie sekwencje rozdzielające, który podlega obróbce do dojrzałych CRISPR RNA (crRNA). 

Ostatnim etapem procesu jest interferencja prowadząca do degradacji obcego materiału genetycznego. W wyniku asocjacji crRNA z białkami Cas powstają kompleksy rybonukleoproteinowe zdolne do rozpoznawania swoistych sekwencji kwasów nukleinowych i hydrolizy wiązań fosfodiestrowych w ich obrębie. Rozpoznawanie obcych elementów genetycznych polega na oddziaływaniu crRNA z komplementarną sekwencją w obcym DNA. CRISPR-Cas jest jedynym narzędziem inżynierii genomowej, w którym swoistość rozpoznawanej sekwencji opiera się na parowaniu zasad DNA-RNA, zgodnie z modelem Watsona-Cricka, a nie – jak w przypadku ZFN czy TALEN – na oddziaływaniach białko – DNA.

Wykorzystanie systemu CRISPR-Cas umożliwia znacznie bardziej wydajne, tańsze, prostsze i szybsze edycje genomów w stosunku do metod tradycyjnych, opartych tylko na zjawisku rekombinacji homologicznej. Dzięki systemowi CRISPR-Cas można tworzyć zwierzęce modele różnych chorób genetycznych. Wprowadzane mutacje do genomu mogą odzwierciedlać mutacje znajdowane u osób cierpiących na poszczególne choroby. Możliwość edycji wielu loci jednocześnie pozwala na tworzenie zwierzęcych modeli chorób wielogenowych.

***

Zastosowanie systemu CRISPR-Cas najprawdopodobniej zmieni zasadniczo możliwości medycyny i farmacji w leczeniu różnych chorób. Odpowiednio wielka batalia o patenty już trwa, wiadomo też, dlaczego wartość rynkowa terapii genetycznych z udziałem systemu CRISPR-Cas jest ogromna.

Istnieje duża różnica między immunoterapią bazującą na wyhamowaniu, tzn. punkty kontrolne (o czym pisaliśmy ostatnio), a terapią genową. Inhibitory punktów kontrolnych działają przede wszystkim na nowotwory, jak: czerniak, nowotwór płuc, nowotwór pęcherza. Terapię genową za pomocą komórek CAR-T wykorzystuje się w leczeniu nowotworów krwi. Wielkim wyzwaniem, ale i nadzieją, jest połączenie w przyszłości tych dwóch terapii.

Ale na tym jeszcze nie koniec, gdyż sama terapia to nie wszystko. Do odpowiednej terapii genowej konieczna jest szeroka diagnostyka pacjenta i choroby. Klinicyści i diagności muszą odpowiedzieć na wiele pytań, nie tylko przed terapią, ale także w jej trakcie i po. Dopiero wtedy taka terapia ma największy sens dla pacjenta i szkodzi mu najmniej.
 

Artykuł został również opublikowany w nr 5/2017 dwumiesięcznika "Przemysł Farmaceutyczny"