W dniu 22 lipca 1964 r. w Strasburgu przedstawiciele 9 państw europejskich: Belgii, Francji, Holandii, Irlandii, Luksemburga, Niemiec, Szwajcarii, Wielkiej Brytanii i Włoch podpisali Konwencję o Opracowaniu Farmakopei Europejskiej (Ph. Eur.), tym samym rozpoczynając na terenie naszego kontynentu proces harmonizacji wymagań farmakopealnych dotyczących jakości surowców farmaceutycznych i metod ich badania, a także wymagań jakościowych dla produktów leczniczych i ich opakowań. Polska ratyfikowała tę Konwencję w grudniu 2006 r. jako 36 kraj. Szereg państw, które nie podpisały Konwencji, ma status obserwatorów prac Komisji Farmakopei Europejskiej. Wśród nich są: Albania, Algieria, Argentyna, Armenia, Australia, Białoruś, Brazylia, Kanada, Chiny, Gruzja, Izrael, Kazachstan, Madagaskar, Malezja, Mołdawia, Maroko, Rosja, Senegal, Syria, Tunezja, Ukraina oraz Stany Zjednoczone. Zgodnie z postanowieniem Konwencji kraje – sygnatariusze zobowiązują się do podjęcia działań zapewniających, że monografie Ph. Eur. staną się oficjalnymi standardami stosowanymi na ich terytoriach, zastępując wymagania farmakopei narodowych.
        W celu ujednolicenia wymagań farmakopealnych obowiązujących na świecie i ustalenia jednolitych metod badania produktów leczniczych od kilku lat toczy się proces harmonizacji Farmakopei Europejskiej – Ph. Eur., Farmakopei Amerykańskiej - USP i Farmakopei Japońskiej - JP. W listopadzie 2005 r. grupa koordynująca proces harmonizacji (Pharmacopoeial Discussion Group) uzgodniła, że nastąpi ujednolicanie monografi i dotyczących mikrobiologii. Proces harmonizacji jest bardzo złożony, m.in. ze względu na odmienną historię rozwoju przemysłu farmaceutycznego, różne tradycje i postęp naukowy na terenach Europy, Stanów Zjednoczonych i Japonii. Każdy region ma doświadczenie w wykonaniu badań swoimi metodami i przeświadczenie o prawidłowości otrzymanych wyników.

       Różnice w obowiązujących przepisach prawnych, a także różnice językowe utrudniają proces harmonizacji. Ponadto na terenie Europy występuje dodatkowe zróżnicowanie - w poszczególnych krajach opracowywane są farmakopee narodowe.

 Opracowania krajowe
       Obecnie w Polsce obowiązuje Farmakopea Polska wydanie VIII. Ukazała się w grudniu 2008 r. w postaci 3 tomów obejmujących tłumaczenie Ph. Eur. wydanie 6.0 wraz z suplementami Ph. Eur. 6.1 i 6.2. Jednakże w przypadku tekstów, których aktualna wersja zamieszczona jest w FP VII, pod tytułem tekstu lub monografi i znajduje się jedynie odpowiednie odwołanie do tomu I FP VII lub Suplementu 2007 FP VII, z podaniem dodatkowo numeru strony. Ponadto opublikowano Suplement 2009 FP VIII obejmujący suplementy Ph. Eur. 6.3, 6.4 i 6.5 oraz Suplement 2010 FP VIII obejmujący suplementy Ph. Eur. 6.6, 6.7 i 6.8. Korzystanie z Farmakopei Polskiej jest więc utrudnione ze względu na obecność obowiązujących monografi i w poszczególnych tomach. Sytuacja wkrótce się zmieni, ponieważ od stycznia 2011 roku obowiązuje już Ph. Eur. 7.0. Stosując się do postanowień Konwencji o Opracowaniu Farmakopei Europejskiej oraz ustaleń dotyczących tłumaczenia Ph. Eur. na język polski, pod koniec 2011 r. ukaże się kumulatywne wydanie FP IX obejmujące zasadnicze 2 tomy Ph. Eur. 7.0 oraz suplementy 7.1 i 7.2.

 Metody mikrobiologiczne ogólnie
      Zagadnienia mikrobiologiczne dotyczące produktów leczniczych poruszane są w Farmakopei w wielu monografiach. Zasadniczo farmakopealne metody mikrobiologiczne stosowane w badaniu jakości produktów leczniczych, a także wyrobów medycznych można podzielić na 4 klasy:
• wykrywanie obecności drobnoustrojów (wszystkich lub określonych) w badanej próbce,
• liczenie komórek drobnoustrojów w badanej próbce,
• identyfikacja i charakterystyka drobnoustrojów obecnych w badanej próbce lub wyhodowanych z przesiewów,
• określenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej substancji czynnych (antybiotyki, witaminy, środki konserwujące, antyseptyczne) w stosunku do testowych szczepów bakterii lub grzybów.

 Monitoring leków jałowych
       Pod względem mikrobiologicznym produkty lecznicze dzielimy na 2 grupy - jałowe oraz niejałowe, lecz spełniające odpowiednie kryteria czystości mikrobiologicznej.
       Ważną rolę odgrywają wyroby medyczne (np. igły, strzykawki, cewniki), służące do podawania chorym niektórych ww. form leków, które również muszą być jałowe. Trzy monografie farmakopealne dotyczą sposobu wytwarzania produktów jałowych, metod ich sterylizacji oraz kontroli procesu sterylizacji, wymaganego podczas walidacji cyklu wytwórczego. Są to: 5.1.1. Metody sporządzania produktów jałowych, 5.1.2. Biologiczne wskaźniki kontroli procesu sterylizacji oraz 5.1.5. Zastosowanie współczynnika F0 do oceny wyjaławiania nasyconą parą wodną preparatów wodnych.
       Kolejne monografie dotyczą przeprowadzania badań jałowości, dokładnie określają zasady prowadzenia kontroli jakości produktów sterylnych z uwzględnieniem wielkości opakowań jednostkowych i ich liczebności w serii produkcyjnej (2.6.1. Jałowość, 5.1.9. Wskazówki do stosowania badania jałowości, 2.6.27. Kontrola mikrobiologiczna produktów komórkowych).

     Szereg preparatów podawanych pozajelitowo musi nie tylko spełniać kryterium jałowości, lecz również nie zawierać substancji gorączkotwórczych – spełniać kryterium apirogenności. W tym wypadku powszechnie stosowane są monografie farmakopealne 2.6.8. Pirogeny, 2.6.14. Endotoksyny bakteryjne oraz 5.1.9. Wskazówki do stosowania badania endotoksyn bakteryjnych.
       Biorąc pod uwagę niedoskonałości powyższych metod, do oznaczania pirogenów stosuje się żywe zwierzęta laboratoryjne (króliki), a w teście LAL, z użyciem odczynników zawierających hemolimfę skrzypłoczy, można wykrywać tylko niektóre pirogeny - endotoksyny bakteryjne wytwarzane przez bakterie Gram-ujemne. Z tego też względu poszukiwano nowej metody in vitro pozwalającej na wykrywanie wszystkich pirogenów. Wydaje się, że opracowana nowa monografia (2.6.30. Badanie aktywacji monocytów), w której przedstawiono metodę pośrednią – badania aktywacji monocytów, może być używana do  wykrywania lub oznaczania ilościowego substancji, które aktywują ludzkie monocyty lub komórki monocytarne do wydzielania endogennych mediatorów, takich jak: pozapalne cytokiny, np. czynnik martwicy nowotworu alfa, interleukina-1 beta i interleukina-6. Cytokiny te odgrywają rolę w patogenezie gorączki. Badanie aktywacji monocytów pozwala na wykrycie obecności pirogenów bakterii zarówno Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich i prawdopodobnie w przyszłości zastąpi wyżej przedstawiane monografie.

 Leki wielodawkowe pod kontrolą
        Część jałowych produktów leczniczych wytwarzana jest w opakowaniach wielodawkowych (np. krople do oczu, iniekcyjne preparaty weterynaryjne). Z punktu widzenia mikrobiologicznego jest ważne zabezpieczenie leku znajdującego się w opakowaniu otwartym po pierwszym użyciu, przed skażeniem bakteriami lub grzybami. Skład niektórych produktów leczniczych nie sprzyja rozwojowi drobnoustrojów i w przypadku niewielkiego zanieczyszczenia  może dojść do zniszczenia drobnoustrojów. Do wielu innych produktów leczniczych dodaje się odpowiednie substancje konserwujące w ilości zapewniającej skuteczną ochronę przeciwbakteryjną i przeciwgrzybiczą. Odpowiednia farmakopealna metoda badania przedstawiona jest w monografii i 5.1.3. Skuteczność ochrony przeciwdrobnoustrojowej.

Obecnie w Polsce obowiązuje Farmakopea Polska wydanie VIII. Ukazała się w grudniu 2008 r. w postaci 3 tomów obejmujących tłumaczenie Ph. Eur. wydanie 6.0 wraz z suplementami Ph. Eur. 6.1 i 6.2.

      Aby ograniczyć ryzyko zakażenia związanego z używaniem opakowań wielodawkowych, część wytwórców stosuje opakowania jednodawkowe (np. małe, jednodawkowe krople do oczu). Inni używają opakowania uniemożliwiające wniknięcie powietrza do opakowania w miejsce wydozowanego leku lub stosują filtry o wielkości porów nie większej niż 0,22 μm, nieprzepuszczające do opakowania komórek drobnoustrojów obecnych w powietrzu. Ze względu na pojawiającą się nadwrażliwość poszczególnych osób na środki konserwujące, zwłaszcza stosowane do zabezpieczania preparatów do oczu, pojawiły się na rynku opakowania z filtrami pochłaniającymi związki konserwujące znajdujące się w produkcie leczniczym. Dawka leku  podawana z takiego opakowania nie zawiera już dodatku środków konserwujących.

 Badania czystości mikrobiologicznej
        Wszystkie pozostałe produkty lecznicze dopuszczone do obrotu oraz substancje stosowane do celów farmaceutycznych muszą spełniać odpowiednie kryteria czystości mikrobiologicznej. Zagadnienie to jest omawiane w 2 kluczowych monografiach farmakopealnych: 2.6.12. Badanie czystości mikrobiologicznej produktów niejałowych (mikrobiologiczne badania ilościowe) oraz 2.6.13. Badanie czystości mikrobiologicznej produktów niejałowych (badanie obecności określonych drobnoustrojów). Opisano w nich metody ilościowe i jakościowe stosowane do kontroli statusu mikrobiologicznego różnych produktów leczniczych wytwarzanych w rozmaitych formach farmaceutycznych.
        Ze względu na możliwe duże zanieczyszczenie mikrobiologiczne surowców roślinnych oraz specyfikę procesu wytwórczego produktów leczniczych roślinnych do podania doustnego, w ostatnim czasie opracowano specjalną monografię (2.6.31. Badanie mikrobiologiczne produktów leczniczych roślinnych do podania doustnego).

 Wymagania dla leków niejałowych
        Wszystkie niejałowe produkty lecznicze znajdujące się na rynku powinny spełniać odpowiednie kryteria czystości mikrobiologicznej. Ważnym dokonaniem na drodze poprawy jakości mikrobiologicznej leków było wprowadzenie w ostatnim czasie również wymagań dotyczących dopuszczalnego zanieczyszczenia bakteriami i grzybami surowców do produkcji farmaceutycznej. Obecnie parametr ten jest określony albo w monografii szczegółowej surowca, albo stosuje się ogólną zasadę, że zanieczyszczenie mikrobiologiczne w jednym gramie lub mililitrze preparatu nie może być większe niż 103 komórek bakterii tlenowych oraz 102 komórek grzybów. Fakt harmonizacji monografi i spowodował wprowadzenie do opisu badań i kryteriów jakości nowych pojęć: TAMC – total aerobic microbial count – ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych oraz TYMC – total yeast/ molds count – ogólna liczba pleśni i drożdży. Zastosowano również duże uproszczenie interpretacji wyników badań. Przyjmuje się, że ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych (TAMC) jest równa liczbie CFU (jednostek tworzących kolonie) znalezionych na podłożu agarowym z hydrolizatem kazeiny i soi. Jeżeli kolonie grzybów są wykrywane na tym klasycznym podłożu dla bakterii,  zaliczane są do części TAMC. Przyjmuje się również, że ogólna łączna liczba drożdży i pleśni (TYMC) jest równa liczbie CFU znalezionych na podłożu agarowym Sabouraud z dekstrozą; jeżeli kolonie bakterii są wykrywane na tym klasycznym podłożu dla grzybów, zaliczane są do części TYMC.
       Ze względu na specyfikę produktów leczniczych roślinnych do podawania doustnego opracowano odrębne kryteria, wyodrębniając 3 klasy produktów z uwzględnieniem dodawanych substancji pomocniczych, metod przetwarzania, a także poddawania działaniu wrzącej wody.
      Niektóre produkty lecznicze niejałowe podawane są w opakowaniach wielodawkowych (np. syropy). W takim wypadku ważne jest zabezpieczenie leku przed rozwojem drobnoustrojów, które mogą dostać się z powietrzem do otwartego opakowania i namnażać się podczas wielodniowego stosowania produktu leczniczego. 
       W tym wypadku zastosowanie ma monografia 5.1.3. Skuteczność ochrony przeciwdrobnoustrojowej. W trosce o wysoką jakość mikrobiologiczną produktów farmaceutycznych, opracowania farmakopealne nie ograniczają się tylko do zagadnień związanych z badaniami jałowości lub czystości mikrobiologicznej, lecz także odnoszą się do innych aspektów.

 Oznaczanie aktywności przeciwdrobnoustrojowej
       Zawartość antybiotyków w produktach leczniczych coraz powszechniej oznaczana jest chemicznymi metodami analitycznymi, takimi jak np. chromatografi a cieczowa HPLC, elektroforeza kapilarna czy spektrofotometria. Jednakże tylko metodą mikrobiologiczną można określić aktywność przeciwdrobnoustrojową i oznaczyć moc antybiotyku w produkcie leczniczym. Celowi temu służy monografia 2.7.2. Mikrobiologiczne metody oznaczania aktywności antybiotyków.
        Aktualnie w Komisji Farmakopei Europejskiej toczy się dyskusja na temat możliwości i celowości wprowadzenia do Ph. Eur. nowej monografi i dotyczącej badania aktywności bakteriobójczej i grzybobójczej deklarowanej przez wytwórców dla antyseptycznych produktów leczniczych – preparatów rozpuszczalnych /zawieszanych/ rozcieńczanych w wodzie, przeznaczonych do bezpośredniego kontaktu ze skórą lub błonami śluzowymi. Monografie takie zamieszczone są od lat w Farmakopei Francuskiej i Farmakopei Włoskiej. W badaniach aktywności przeciwdrobnoustrojowej stosuje się metody znormalizowane: EN 1040:2006: Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne - Ilościowa zawiesinowa metoda określania podstawowego działania bakteriobójczego chemicznych środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych - Metoda badania i wymagania (faza 1) oraz EN 1275:2006: Chemiczne środki dezynfekcyjne i antyseptyczne - Ilościowa zawiesinowa metoda określania podstawowego działania grzybobójczego lub podstawowego działania bójczego wobec grzybów drożdżopodobnych chemicznych środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych - Metoda badania i wymagania (faza 1).
        Wydaje się, że celowe jest opracowanie takiej monografii, biorąc pod uwagę badania przeprowadzone w Narodowym Instytucie Leków, wykazujące niewielką aktywność bakteriobójczą szeregu preparatów (produktów leczniczych i kosmetyków) dostępnych na naszym rynku, a przeznaczonych do dezynfekcji jamy ustnej.

Bezpieczeństwo produktów leczniczych

      Podczas procesu wytwarzania niektórych produktów leczniczych biotechnologicznych, szczepionek lub produktów biologicznych, stosowane są hodowle in vitro linii komórkowych lub tkanek. Bardzo ważna jest kontrola czystości mikrobiologicznej tych produktów i wykluczenie obecności trudnych do wykrycia drobnoustrojów. W celu zapewnienia właściwej kontroli linii komórkowych i tkanek opracowano 2 monografie: 2.6.2 Mykobakterie i 2.6.7. Mykoplazmy. Jak wspomniano wcześniej, spośród wszystkich surowców stosowanych w farmacji, w surowcach pochodzenia naturalnego obserwuje się największe skażenie mikrobiologiczne. Zwłaszcza niebezpieczne jest zanieczyszczenie surowców grzybami. Niektóre szczepy mogą wytwarzać toksyny - aflatoksyny, powodujące objawy chorobowe u ludzi. Aby określić możliwe ryzyko, opracowano odpowiednie monografie: 2.8.18. Oznaczanie aflatoksyny B1 w substancjach roślinnych, 2.8.22. Oznaczanie ochratoksyny A w substancjach roślinnych.

     Mikrobiologiczna kontrola jakości produktów leczniczych zasadniczo sprowadza się do przeprowadzenia badań bakteriologicznych i mikologicznych. Jednakże istnieje jeszcze inne potencjalne niebezpieczeństwo wtedy, gdy materiały pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego są stosowane jako składniki produktów leczniczych lub stosowane są w procesie wytwarzania substancji czynnych, substancji pomocniczych lub produktów leczniczych. Nie prowadzi się bowiem kontroli produktów leczniczych na obecność wirusów i prionów, lecz stosuje się odpowiednie postępowanie w celu zmniejszenia danego ryzyka – w tym celu opracowano 2 monografie: 5.1.7. Bezpieczeństwo wirusowe oraz 5.2.8. Zmniejszenie ryzyka przenoszenia czynników wywołujących zwierzęce, gąbczaste encefalopatie przez produkty lecznicze stosowane u ludzi i w weterynarii.
         Uzyskanie wyniku z hodowli wymaga wielodniowej inkubacji, np. podczas badania jałowości inkubację płytek z posianym materiałem trzeba prowadzić 14 dni. Wykrywanie obecność bakterii Mycoplasma sp. trwa 35 dni, a prątków Mycobacterium sp. aż 56 dni. Magazynowanie serii wytworzonego produktu leczniczego, przed dopuszczeniem do obrotu - niekiedy w obniżonej temperaturze, z powodu oczekiwania na ostateczny wynik badania mikrobiologicznego zwiększa koszty wytwarzania produktu leczniczego. Ponadto metody biologiczne obarczone są dużym błędem i trudne są do walidacji. Dodatkowy problem pojawił się z wraz z opracowaniem nowych produktów leczniczych o bardzo krótkim okresie przydatności w terapii, takich jak radiofarmaceutyki czy nośniki biologiczne w terapii genowej. W związku z powyższymi zastrzeżeniami i trudnościami, pojawiła się konieczność przyspieszenia uzyskania wyniku badań mikrobiologicznych.

      Jednakże podjęte wysiłki nie zaowocowały istotnym przyspieszeniem uzyskania wyniku badań mikrobiologicznych, dlatego też rozważono wprowadzenie nowych, alternatywnych metod mikrobiologicznych, już nieopartych o hodowlę drobnoustrojów i ich analizę. Opracowano odpowiednią monografię – 5.1.6. Metody alternatywne stosowane do kontroli jakości mikrobiologicznej.

Woda - podstawowy surowiec
       Jednym z surowców używanym do produkcji farmaceutycznej w największej ilości jest woda. Jakość mikrobiologiczna wody ma istotne znaczenie dla jakości produktu końcowego. W Farmakopei opracowano szereg monografii dotyczących wody do celów farmaceutycznych. Sterylna jest tylko woda w pojemnikach do wstrzykiwań oraz w pojemnikach do receptury aptecznej. Kolejne monografie określają odpowiednią czystość mikrobiologiczną wody:
• woda do wstrzykiwań (produkcyjna),
• woda wysokooczyszczona,
• woda oczyszczona (produkcyjna oraz w pojemnikach),
 • woda do rozcieńczania koncentratów do hemodializy,
• woda do receptury aptecznej (do bezpośredniego użycia).
      

Zawartość antybiotyków w produktach leczniczych coraz powszechniej oznaczana jest chemicznymi metodami analitycznymi. Jednakże tylko metodą mikrobiologiczną można określić aktywność przeciwdrobnoustrojową i oznaczyć moc antybiotyku w produkcie leczniczym.

       Nowa, ważna monografia, 2.9.39. Interakcje woda – ciało stałe: wyznaczanie izoterm sorpcji i desorpcji oraz aktywności wody, znalazła się w Ph. Eur. 7.1 i będzie umieszczona w najnowszym wydaniu IX Farmakopei Polskiej. Zwrócono w niej uwagę na aktywność wody (Aw). Jest wielkość wskazująca na zawartość wody niezwiązanej krystalicznie lub atomowo, która może przyspieszać szybkość reakcji chemicznych oraz jest istotna dla rozwoju drobnoustrojów.  Wraz ze zwiększaniem się aktywności wody do wartości 1, zwiększa się korzystne oddziaływanie środowiska na drobnoustroje i rośnie prawdopodobieństwo ich namnażania się w produkcie leczniczym. Im większe jest stężenie substancji rozpuszczonej, tym niższa wartość Aw. Można ją obniżać poprzez dodatek cukrów (fruktoza, sorbitol) glikolu polietylenowego, zatężanie, suszenie. Przyjmuje się, że bakterie Gram-ujemne nie rosną w środowisku o Aw poniżej 0,95; gronkowce, mikrokoki, pałeczki kwasu mlekowego nie rosną, gdy Aw < 0,9; większość drożdży, gdy Aw < 0,8, a chorobotwórcze grzyby Aspergillus glaucus nie rosną, gdy Aw < 0,6. Dla porównania aktywność wody w kremach farmaceutycznych zawiera się w przedziale 0,8 - 0,98.

* * *

         Wymienione powyżej liczne monografie farmakopealne mają na celu zapewnienie właściwej kontroli mikrobiologicznej i uzyskanie bezpiecznego produktu leczniczego o dobrej jakości. Sprzyja temu również coraz powszechniejsze przestrzeganie zasad Dobrej Praktyki Wytwarzania. Zwłaszcza istotny jest niedawno wprowadzony Aneks 1 „Wytwarzanie sterylnych produktów leczniczych” do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 17.08.2009 r. „zmieniającego rozporządzenie w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania” (Dz. U. 135 z 2009 r., poz. 1114).

Autor: prof. dr hab. Stefan Tyski, Narodowy Instytut Leków, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Artykuł został opublikowany w magazynie "Przemysł farmaceutyczny" nr 3/2011